浅析mRNA疫苗的工艺流程
新冠病毒的蔓延促进了mRNA技术的发展，成为2021年《麻省理工科技评论》发布的“全球十大突破性技术”名单的榜首，并指出mRNA技术在各种传染病与肿瘤等治疗方面拥有广阔的应用前景。《麻省理工科技评论》全球十大突破性技术
目前，在Clinical Trial网站上，有大约80项有关mRNA技术的临床试验在开展，有用来制备流感疫苗、宫颈癌疫苗、非小细胞肺癌疫苗、食管癌疫苗、新冠疫苗等。随着mRNA疫苗研发管线越来越丰富，商业化产品越来越多，其生产工艺也正在逐渐趋于成熟，主要流程为：
mRNA的工艺流程：
01质粒的制备及线性化
质粒DNA主要是通过大肠杆菌的表达获得，其技术已经相当成熟，获得纯化的质粒后，用限制性内切酶对质粒进行酶切，处理成线性化双链DNA模板，作为mRNA体外转录的模板。之前有文章报导滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）可以不用PCR，37度扩增质粒，此技术用了一个特殊的DNA聚合酶phi29，它可以自己打开DNA双链，无需PCR反应加热解双链。虽然此过程不需要细胞参与，大大提高了工作效率，但目前未见用于工业化。
02mRNA的体外转录
mRNA的体外转录有两种方式：一种是以线性化质粒为模板，利用含有T7启动子或SP6启动子条件下，以NTP为底物，使用RNA聚合酶合成mRNA再进行修饰；另一种是先进行加帽、加尾及碱基类似物修饰，再利用T7 RNA聚合酶合成mRNA。 mRNA的分子结构特征Pharmaceutics.2020 Feb;12(2):102
03mRNA的加帽加尾
mRNA转录后或在转录过程中需要加帽加尾，主要作用是提高mRNA的翻译效率，维持mRNA的稳定性。mRNA的加帽过程主要是在mRNA 5´端第一个核苷酸上添加7 - 甲基鸟苷（m7G），可保护mRNA免于降解，增加可议性及调高剪接效率，是促进核糖体靶定到mRNA进行翻译的关键因子。帽结构共分为三类：Cap 0，Cap 1，Cap 2，目前有三种工艺路线进行加帽反应：1）转录完成后，通过加帽酶、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）与GTP进行加帽。此方法采用酶学法，利用牛痘病毒加帽系统，使用天然帽，系统内含RNA三磷酸酶、鸟嘌呤甲基转移酶及鸟嘌呤转移酶、甲基供体SAM、GTP和反应缓冲液。此反应将Cap 0 mRNA转化为Cap 1 mRNA，反应时间较短，帽结构以正确方向进行添加，加帽效率接近100%，效率较高，但是需建立额外的酶反应体系。2）转录过程中加入帽结构类似物。在转录反应中添加mRNA帽类结构类似物，如利用抗-反帽结构类似物（ARCA）共转录定向加帽，这种转录方式产量较低，但是反应速度快。3）Cleancap技术，通过模仿产生天然Cap 1结构，减少模式识别受体的激活，降低对宿主先天免疫系统的刺激，解决与ARCA相关的加帽效率低或酶成本高的问题。此方式加帽效率高于94%且毒性小，技术简便，是新一代加帽技术。mRNA的加帽技术* 以上图片来源于网络mRNA 3´端有一段多聚腺苷酸尾，称Poly A尾，与mRNA 5´端的5´Cap共同调解mRNA的翻译效率，长度最佳为120-150个核苷酸，过长或过短都会影响mRNA的稳定性和翻译效率，是否含有Poly A 尾也会影响翻译效率。mRNA的Poly A尾具备可以助力mRNA从核到细胞质的转运与降低mRNA受到核酶的降解，增强mRNA的稳定性等功能。mRNA加尾方式有两种：1) 通过使用重组Poly A聚合酶进行修饰，但制备出的Poly A尾长度不同，会影响翻译效率。此方法受温度和时间影响，RNA降解快，需计算RNA与ATP的比例。2) 通过在模板中设计编码固定长度的序列，在体外直接转录生成，此方法操作简单，可以明确Poly A尾的长度。
04mRNA的纯化
通过反转录及酶反应获得的mRNA产物会产生截短型RNA、双链(ds)RNA、反应物等杂质，在下游的纯化工艺中需要进行去除。目前主要的mRNA纯化技术有：1）Oligo(dT)亲和层析：通过与Poly A尾结合，进行亲和纯化，可以去除大部分NTPs、酶、DNA等杂质，但不能区分dsRNA和截短型RNA。2）离子交换色谱IEC：通过等电点不同来做纯化，对dsRNA和截短型RNA都有一定的区分能力，一般作为精制纯化。IEC在单抗生产中已经很成熟，可以实现工艺快速放大。3）疏水层析HIC：可以作为精制纯化步骤，进一步区分dsRNA与截短型RNA，但此方法放大有难度。4）离子对反向色谱法：可以很好地通过疏水性来区分目标产物，分离效果佳，但是反相柱难以放大，且乙腈毒性也较大。
05mRNA的递送
由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，无法通过细胞膜的阴离子脂质双层，因此体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，有多种技术用于mRNA的递送，其中最广泛应用的是脂质纳米颗粒LNP。LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂组成，主流的LNP制备方法是微流控混合法，将含有脂质的乙醇溶液和含有核酸的水溶液，分别注入制备系统的两条通道，在层流中两相不会立即混合，通过通道中设计的微观特征可重复地控制两相的混合，从而快速、可控、均匀的混合产生纳米颗粒。LNP 脂质纳米颗粒
06LNP的浓缩换液
传统的浓缩换液采用的是切向流超滤TFF技术，主要是形成循环浓缩，上游料液在浓缩过程中会承受泵、管路和超滤膜包的剪切力作用。PALL拥有Single Pass TFF技术，通过膜结构的内部改变，使料液在膜包内单向流动一次，在回流端获得浓缩后的料液，通过增加流路长度达到浓缩效果。这种技术大幅度降低了料液循环次数，并大大降低膜包剪切力，对剪切比较敏感的LNP、蛋白、病毒等具有保护作用。
Single Pass TFF 单向流动模式07mRNA生产的工艺方案
对于mRNA的整个生产工艺来说，丹纳赫生命科学拥有两种工艺路线方案。路线一：采用一次性混合器或反应器进行质粒的线性化、体外转录、加帽加尾以及DNA降解反应，使用超滤膜包或中空纤维进行超滤浓缩，LNP浓缩换液采用PALL的Single Pass TFF技术，除菌过滤也是采用PALL的囊式滤器。此种路线适用于mRNA转化效率高、DNA降解得比较好的工艺流程。
mRNA工艺路线1
线路二：加入了层析的步骤，实现对mRNA的富集和纯化。
mRNA工艺路线2
随着越来越多的企业加入到mRNA药物的研发和生产中，选择适合自己的工艺路线，达到效率、质量和成本的相对平衡是需要考虑的重要因素，丹纳赫生命科学多样化的mRNA制备方案给用户提供了不同的选择方向。
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