HEK293 HCP ELISA：病毒纯化工艺适合，才是王道

cellgenebio

来源简介
人胚胎肾脏成纤维293细胞，通常指的是HEK 293，HEK-293，293 cells，都是从1970s的一个受孕女性胚胎中分离得到的永生化细胞系[1]。
1973年，来自荷兰，莱顿的Alex van der Eb实验室，第一次将腺病毒DNA转染进体外培养的293细胞中。1977年，Frank Graham在McMaster大学发表了HEK转染的文献，因为恰好HEK细胞已经传代了293次，所以就命名为HEK293细胞。
一项关于HEK 293细胞系及其五个衍生细胞系的基因组和转录组的全面研究，将HEK 293的转录组与人类肾脏、肾上腺、垂体和中枢神经组织的转录组进行了比较。发现该细胞的性质与肾上腺更接近[2]。

表达优势
经过多年的发展，来源于肾脏的HEK293细胞发展成，广泛应用的成纤维型，内皮型和上皮型细胞。细胞形态多为三角形或梭形，见图1。
使用腺病毒感染HEK293细胞，经过测序验证发现腺病毒约4.5kbp的左臂基因组，整合到了细胞的19号染色体上[3]。由此，使用腺病毒携带不同基因，对HEK293细胞进行改造，生成了适应不同药物的多种细胞亚株。
经过十年的发展，目前工业与科研界已经进化出了，293f，293T和293S等类型。见图2。如上述提到的，在1973年，HEK293，可以感染Ad5腺病毒，筛选永生化细胞；在1984年，HEK293S能够实现MEN培养基的悬浮生长；在1985年，筛选到温感的SV40 T细胞大抗原细胞系，增加了SV40起始子的表达量；1993年的HEK293H，该细胞贴壁状态下，生长迅速，蛋白表达水平高，适应了serum-free medium；随后，又衍生出了HEK293FT，一种能够感染慢病毒的neo抗性突变的细胞；2014年，优化出适合商业化大规模培养的HEK293F；期间，HEK293E（EBVA）和HEK2936E，前者能够表达EBNA-1蛋白，后者能够表达Gly-Gly-Ala重复区域缺失的EBNA1t蛋白；还有2001年的HEK293FTM，含有稳定转染的FRT位点和TetR质粒；还有2002年的HEK293SG，2010年的HEK293SGGD，HEK293A，HEK293MSR等适应不同功能和药物的改造细胞系。其修饰的靶基因与包括细胞增殖、凋亡、中心碳代谢、聚糖谱均一性、糖基化效率、蛋白质折叠、分泌系统、蛋白质表达等功能相关。
目前哺乳动物表达系统应用最成熟，最广泛的仍然是CHO表达系统。但是对于快速瞬转，人物种翻译后修饰相似性，还有大分子蛋白复合物颗粒的表达，293系统有着核心的优势。所以，293系统仍然是最有应用潜力的哺乳动物表达系统之一。与CHO的表达优势比较，见下表1：

表1

基因改造
因为293的核心优势，科研与工业界不断对293基因组进行改造，主要关注细胞凋亡，细胞增殖，细胞中心碳代谢，糖基化，蛋白折叠，蛋白分泌等功能。借助的技术手段主要是通过miRNA和siRNA为主的敲除和敲降抑制，进行蛋白组学分析，做合适表达条件的高通量筛选，见下图3。

图3

基因功能，如Cyclin-dependent kinase like 3 (CDKL3)基因，能够增强蛋白表达的，促进G1-S转化的细胞周期基因和促进合成功能的Cytochrome c oxidase subunit 15 (COX15)基因。还有一些细胞生长类的基因，如Cyclin-dependent Kinase inhibitor 2C (CDKN2C)，也是调节G1进程；抑制细胞凋亡蛋白合成的B-cell lymphoma 2 (BCL2)基因；降低脱氢酶激酶活性，并增加细胞质中丙酮酸向乳酸的转化的Dehydrogenase kinase (PDK)。除此之外，还有敲除高甘露糖修饰的MGAT1基因。其中高频的甘露糖修饰，会增加药物的那白被修饰的风险，且更容易被呈递给免疫细胞，增加药物的体内清除可能。相关基因类型，如下表2所示。

表2

基于上述HEK293的功能和应用潜力，赛唐生物开发了HEK293 HCP ELISA（HH-H0019-3A1）试剂盒。该试剂盒的DL与QL可以控制在0.39ng/mL和0.78ng/mL。线性表现优异80-120%，已经证实可适用样本为重组单抗，双抗和病毒包装样本。数据见下表3：

表3

同时比较了Cygnus产品，货号： F650S。在（重组蛋白类型）不同药物（相同药物不同纯化阶段）中的检出率，有不错的可比性，见下图4，5。

同时，在病毒包装样本中，从收获液，澄清液和病毒浓缩液样本中，多数高于Cygnus F650S，并远高于国内平行产品的检测结果。通过ELISA进一步验证了客户HCP清除工艺效率，符合客户多年纯化工艺积淀数据。且由于终产物中的HCP识别纯度表现优异，更容易通过药监局审批。见图6-9。

图6                                                    图7

图8                                                      图9

另外，赛唐生物也做了充分的特异性检测，如核酸酶，胰蛋白酶，BSA，HCP等，极大程度上排除了非特异性识别，见下表4：

表4

赛唐生物始终坚持以解决实际问题导向，和药企客户踏实走好每一步。“权威”无法代替技术去解决实际问题，“金标准”不是唯一，但更要和药企一起坚持多年的法规积累，ELISA与LC-MS，二者缺一不可。解决不了ELISA问题，遑论解决以此为基础的LC-MS鉴定问题？脚下悬空很危险，非此即彼不可取。
参考文献：
[1] Kavsan, Vadym M; et al. Immortalized cells and one oncogene in malignant transformation: old insights on new explanation. BMC Cell Biology. 2011. 12: 23.
[2] Yao-Cheng Lin, et al. Genome dynamics of the human embryonic kidney 293 lineage in response to cell biology manipulations. Nature communications. 2014. 5:4767.
[3] Louis N, et al. Cloning and sequencing of the cellular-viral junctions from the human adenovirus type 5 transformed 293 cell line. Virology. 1997. 233 (2): 423-9