昆虫细胞表达新赛道：High five (Hi-5) HCP精准质控方案

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一、背景
     来源历史：昆虫细胞表达系统，是近年来创新药的表达宿主之一。虽然小众，但是在部分药物的成本和功能上，也有其特定的优势。常见的有Sf9，Sf21和High five等。
     High Five cell，是一种来源于于粉纹夜蛾昆虫的卵巢细胞的细胞。于1992年美国植物研究所（Boyce Thompson Institute，BTI）发现的粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni，Tn)来源，克隆号为5B1-4，故而命名编号为BTI-Tn-5B1-4，Tn-5B1-4或High 5，Hi-5，Tn-5等[1]。和Sf9一样，都是可以通过杆状病毒感染/转染，并来表达重组蛋白药物的昆虫细胞系。但是相比Sf9细胞，Hi-5细胞系表达的重组蛋白量更高。且比较特殊的是，Hi-5细胞也被常用于生产大量的小分子核糖核酸、小分子干扰核糖核酸及piRNA药物[2-5]。在我们培养过程中，观察到该细胞是呈淋巴母细胞样的半悬浮生长，且略微松散存在。Hi-5细胞系的原代细胞分离方法，见下图1。

图1

     最初，High 5的分离方式是，取粉纹夜蛾昆虫的卵，70%乙醇消毒和无菌水清洗后，放入培养皿中，分离卵中的胚胎卵巢，然后剪碎成组织碎片，培养24-48小时，来得到High five细胞[6]，细胞状态可见为松散、悬浮、半贴壁，多显示为圆形，见图2A。High five感染eGFP杆状病毒48 hpt，激光共聚焦显示，对细胞核染色(Blue, Hoechst), 细胞膜染色(Red, CellMask™)，胞内eGFP为绿色，见图2B。细胞状态与Manon M. J. Cox报道一致。

图2

     在使用High five细胞进行重组药物表达时，通常使用两种方式，即无病毒瞬时基因表达 (Virus-Free Transient Gene Expression) 和杆状病毒表达载体系统 (BEVS)。前者主要使用PEI脂质体转染，后者用来做杆状病毒是同源重组法 (HR-bac，载体基因类型为BAC10:KO1629, Δv-cath/chiA)感染。工具载体包括pAC8 set，pAC8_MF set，pOPIN set质粒组合。杆状病毒感染Sf9细胞后的效果，如图3。可见感染杆状病毒后，有红色荧光marker表达，见图3A。且western-blotting有显著条带，见图3B。

图3

二、昆虫细胞表达系统的突出特点
     虽然E.coli和CHO HCP表达系统仍然为大分子蛋白蛋白药物的主流，但是无论从翻译后糖基化修饰，成本，产量和基因改造便利程度方面，都有着E.coli和CHO HCP无法比拟的优势，我们统计了昆虫细胞表达的优势与未来趋势[7]，见下表1。

表1

     同时，昆虫细胞常用的转染/感染方式，在不同的应用场景也有各自的优缺点[8]，特点列举[8,9]，见表2。科研/制药者，可以根据场景进行选择。所以昆虫细胞生产的Cervarix和Flublok之类的疫苗药物，和Provenge的治疗性疫苗药物，也凭借性能优势，业已上市[10,11]，见表3。

表2

表3

     最常见的昆虫细胞，有High five，Sf9和Sf21细胞。Sf9和Sf21来源于草地贪夜蛾蛹种属，形态为圆形，基因组与转录组信息也已明确。但是表达能力均低于来源于粉纹夜蛾的High five细胞。且其糖基化相关基因与Sf21更为接近[12-16]，其更详细细胞系特征差别，见表4，5。

表4

表5

三、昆虫细胞 HCP产品开发
     基于上述昆虫细胞表达特征和蛋白药物的应用潜力，由于该表达系统使用较少，且不如CHO细胞研究深入，所以市场上该类HCP较少，尤其是High five HCP ELISA试剂盒产品为中国唯一，全球唯二的存在。
     赛唐生物开发了High five HCP(货号：HF-H0026-3D1)和Sf9 HCP(货号：SF-H0025-3B1)体系产品。为生物医药市场的昆虫细胞表达体系的应用，提供了有力的帮助。并已进一步优化应用，和HCP特征性分析。
     High five HCP ELISA为HRP标记的二抗，形成的双抗体夹心法试剂盒。标曲范围控制在0-800ng/mL，本底控制Blank＜0.15，DL&QL分别为3.128ng/mL & 12.5ng/mL，CV≤10%，且在多种缓冲体系下，有着良好的回收效果（70%-130%）。且4℃稳定性≥1年。经过验证HCP特异性，发现High five HCP与293/E.coli 3s HCP交叉反应＜2%，与/E.coli 6s/X-33/GS115/酿酒酵母HCP无明显交叉反应。数据见图4，表6-8。
Note：原始数据来源，分别为N251713-052，N251713-049和N251713-049。

图4

表6

表7

表8

四、展望
     赛唐生物，专注与聚焦HCP研究与产品开发15年，至此已完成12类，共计24种HCP体系化产品上市。并配套对应技术服务，如，ELISA试剂盒优化与调试，覆盖度分析等。并已协助多款药物进入临床期和上市。
     去除疫情期增长泡沫影响，扎根质量控制。紧跟NMPA监管目标，并跟随中国药企发展阶段来适度更新检测技术。适应中国国情，避免盲目改动，因为避免规格的急速改变，避免增加药企的成本牺牲和负担。始终坚持以解决实际问题导向，和药企客户踏实走好每一步。坚持做小，做精。